Para uma investigação eficiente da DP em pacientes que apresentem sintomas característicos da doença, deve-se seguir uma estratégia laboratorial que garanta um resultado confiável no menor tempo possível. Todos os processos, desde a coleta até a análise dos resultados, devem ser realizados com cautela. 


Etapa 1. Procedimento de coleta e preparo de amostra de sangue seco em papel de filtro (DBS, do inglês dried blood spot) 
a) Fazer a assepsia, puncionar a ponta do dedo com uma lanceta e fazer uma leve compressão, seguida por descompressão.³ Aplicar apenas uma gota de sangue em cada círculo demarcado no papel filtro; não é necessário preencher o círculo todo. 
b) Após o preparo, deixar o DBS secando por pelo menos 4 horas em temperatura ambiente e longe de qualquer superfície absorvente.4
c) Armazenar o DBS dentro de um saco plástico com dessecante sob refrigeração até o envio para o laboratório.³ O transporte pode ser feito em temperatura ambiente.
Obs.: o material pode ser utilizado tanto para análise enzimática quanto para análise molecular.

Etapa 2. Avaliação da atividade enzimática em DBS
A determinação da atividade enzimática deve ser realizada em laboratório especializado e capacitado para tal procedimento. Os valores de referência de cada laboratório e de cada população podem variar e devem ser informados no laudo. Recomenda-se atenção ao interpretar os resultados. 
Interpretação:
– Atividade enzimática compatível com DP: confirmar o diagnóstico pela pesquisa de mutações no gene GAA.²
– Atividade enzimática dentro dos valores de referência do laboratório: excluir o diagnóstico de DP.5

Etapa 3.
Investigação molecular – pesquisa de mutações no gene GAA
Mais de 400 variantes patogênicas já foram descritas no gene GAA, além de inúmeras variantes consideradas benignas e outras com efeito desconhecido (VUS, de variants of unknown significance).5,6 Essas informações estão disponíveis nos bancos de dados públicos e podem ser consultadas pelos profissionais da área.
Interpretação:
– Presença de 2 mutações com efeito patogênico já descrito na literatura: diagnóstico confirmado de DP.5
– Presença de apenas 1 mutação com efeito patogênico descrito na literatura: heterozigoto para DP.5
– Presença de 1 mutação com efeito patogênico descrito na literatura + 1 mutação não descrita, de efeito desconhecido ou 1 polimorfismo: análise inconclusiva. Nessa situação deve-se avaliar a atividade enzimática em outro material biológico (pode tratar-se de heterozigoto ou de paciente com DP).5
– Presença de 2 mutações não descritas na literatura ou de efeito desconhecido: análise inconclusiva. Nessa situação deve-se avaliar a atividade enzimática em outro material biológico (pode tratar-se de heterozigoto ou de paciente com DP).5
– Ausência de mutações: Caso esteja dentro da normalidade, descartar Doença de Pompe. Caso esteja abaixo da normalidade, confirmar com a atividade enzimática em outro tecido.5 

Etapa 4.
 Investigação da atividade da enzima α-glicosidase ácida em fibroblastos ou leucócitos.1,2
Para essa avaliação, é necessário enviar o material específico de análise, isto é, sangue total em tubo com heparina ou fragmento de biópsia de pele para análise em leucócitos ou fibroblastos, respectivamente.2,4
Recomenda-se atenção ao interpretar os resultados, pois os valores de referência variam de acordo com o tecido estudado, a população e o laboratório em que foi feita a análise.
Interpretação:
– Atividade enzimática compatível com DP: diagnóstico confirmado de DP.2
– Atividade enzimática dentro dos valores de referência do laboratório: excluir o diagnóstico de DP.2
 

REFERÊNCIAS

  1. Chamoles NA, Niizawa G, Blanco M, Gaggioli D, Casentini C

    Glycogen storage disease type II: enzymatic screening in dried blood spots on filter paper

    Clin Chim Acta. 2004 Sep;347(1-2):97-102.

  2. Winchester B, Bali D, Bodamer OA, Caillaud C, Christensen E, Cooper A, et al;

    Pompe Disease Diagnostic Working Group. Methods for a prompt and reliable laboratory diagnosis of Pompe disease: report from an international consensus meeting.

    Mol Genet Metab. 2008 Mar;93(3):275-81.

  3. Zhang H, Kallwass H, Young SP, Carr C, Dai J, Kishnani PS, et al

    Comparison of maltose and acarbose as inhibitors of maltase-glucoamylase activity in assaying acid alpha-glucosidase activity in dried blood spots for the diagnosis of infantile Pompe disease.

    Genet Med. 2006 May;8(5):302-6.

  4. Müller KB, Mayra DB Rodrigues MDB, Pereira VG, Martins AM, D’Almeida V

    Reference values for lysosomal enzymes activities using dried blood spots samples − a Brazilian experience

    Diagn Pathol. 2010;5:65.

  5. Burton BK, Kronn DF, Hwu WL, Kishnani PS

    Pompe Disease Newborn Screening Working Group. The initial evaluation of patients after positive newborn screening: recommended algorithms leading to a confirmed diagnosis of Pompe disease.

    Pediatrics. 2017 Jul;140(Suppl 1):S14-S23.

  6. Reuser AJJ, van der Ploeg AT, Chien YH, Llerena J Jr, Abbott MA, Clemens PR, et al.

    GAA variants and phenotypes among 1,079 patients with Pompe disease: data from the Pompe Registry.

    . Hum Mutat. 2019 Jul 24.