INTRODUÇÃO

Dados recentes sugerem que 10 a 30% dos pacientes infectados com o vírus SARS-CoV-2 são assintomáticos e que uma liberação viral significativa pode ocorrer antes mesmo do início dos sintomas da COVID-19. Um grande obstáculo no gerenciamento da pandemia em muitos países é o teste diagnóstico, o qual é realizado principalmente em pacientes sintomáticos devido à limitações da capacidade laboratorial, bem como ao acesso limitado a reagentes de extração do genoma e de reação em cadeia da polimerase (PCR). Portanto, há uma necessidade urgente de aumentar a capacidade dos testes diagnósticos a fim de permitir o rastreamento de populações assintomáticas e pré-sintomáticas e de prevenir a propagação da doença. Para isso, foi desenvolvido o P-BEST, um método de alta eficiência baseado em pooling (agrupamento de várias amostras), que identifica indivíduos positivos em um grande conjunto de amostras usando uma única rodada de testes. O P-BEST pode ser configurado com base na taxa de portadores de uma determinada população e se a taxa de portadores for inferior a 1,3%, o método fornece uma melhora de 8 vezes na eficiência e uma redução de 8 vezes no custo do teste.1  

MÉTODOS

Swabs
de naso e orofaringe foram coletados para análise pelo laboratório de Virologia Clínica do Soroka University Medical Center (SUMC) em Israel. Para a validação inicial do P-BEST, foram utilizadas amostras clínicas remanescentes de pacientes com teste positivo e de pacientes com teste negativo do laboratório de Virologia Clínica do SUMC. Quatro conjuntos de um total de 384 amostras, cada um contendo 2 a 5 amostras positivas, foram criados. Especificamente, as 384 amostras de pacientes foram agrupadas em 48 pools, cada um contendo 48 amostras. Cada amostra foi adicionada a seis pools diferentes. O esquema de agrupamento foi projetado para identificar corretamente todos os portadores positivos em uma população apresentando uma taxa de portadores inferior a 1,3% (Figura 1).1

As amostras agrupadas foram então testadas pelo laboratório de diagnóstico clínico do SUMC usando um protocolo baseado em PCR clinicamente aprovado para a COVID-19. Em seguida, um estudo clínico foi conduzido para rastrear profissionais de saúde do SUMC quanto a infecções por SARS-CoV-2. O estudo recrutou 1.115 indivíduos adultos que se auto-relataram como assintomáticos ou levemente sintomáticos (tosse, coriza, mialgia ou dor de garganta), sem febre, falta de ar ou pneumonia.1
-/media/Sanofi/Conecta/Artigos/2020/08/teste-eficiente-e-de-alto-rendimento-de-sars-cov-2-para-deteccao-de-pacientes-assintomaticos/01_01.ashx?w=892&hash=C95E5836F3E99B3925190D98D140E36D
Figura 1. Desenho e detecção do teste P-BEST. A. Os pools foram gerados usando um projeto de pooling combinatório com base em um código de correção de erros que otimiza a detecção de portadores. O desenho do pool P-BEST, projetado para uma taxa de portadores de aproximadamente 1%, usou 48 pools para testar 384 amostras simultaneamente, proporcionando um aumento de 8 vezes na eficiência do teste, bem como uma redução de 8 vezes nos custos dos reagentes. Cada amostra foi distribuída em seis pools, tendo cada um deles um total de 48 indivíduos. Os indivíduos marcados em vermelho representam os quatro indivíduos infectados não identificados no conjunto de 384 amostras. B. Amostras agrupadas são então tratadas como amostras individuais. O RNA é extraído, seguido pela amplificação por PCR padrão. Os pools positivos foram marcados por círculos vermelhos. C. O P-BEST identificou as amostras positivas entre as 384 amostras usando um algoritmo baseado em otimização com base em detecção compactada. (Adaptado de Shental et al. Sci Adv. 2020:eabc5961.1)

RESULTADOS

O P-BEST foi capaz de identificar corretamente todos os portadores positivos dentro dos quatro conjuntos de um total de 384 amostras. Apenas no conjunto em que havia cinco amostras positivas (taxa de portadores de 1,3%) foi detectado um portador falso positivo adicional (Tabela 1).1

Tabela 1. Resultados dos experimentos de validação
-/media/Sanofi/Conecta/Artigos/2020/08/teste-eficiente-e-de-alto-rendimento-de-sars-cov-2-para-deteccao-de-pacientes-assintomaticos/01_02.ashx?w=900&hash=3C7438735D29DC248912B1BBF5792D4F
(Adaptado de Shental et al. Sci Adv. 2020:eabc5961.1)

Dos 1.115 indivíduos da equipe do SUMC que participaram do rastreamento, 296 (26,5%) tiveram contato direto com pacientes positivos para a COVID-19. Dentre eles, 690 (62%) eram mulheres, 425 (38%) eram homens.1

Os profissionais de saúde recrutados incluíram:1
  • Médicos (n = 165, 14,8%)
  • Enfermeiras (n = 157, 14,1%)
  • Auxiliares de enfermagem (n = 43, 3,9%)
  • Outro corpo clínico (n = 119, 10,7 %)
  • Pessoal administrativo (n = 631, 56,6%)
Os participantes relataram:1
  • Ausência de sintomas (n = 926, 93,1%)
  • Tosse leve (n = 71, 6,3%)
  • Rinorreia (n = 70, 6,3%)
Todos os pools de amostras dos 1.115 indivíduos testados deram negativo.1  

DISCUSSÃO

O P-BEST é um novo método para o teste diagnóstico de SARS-Cov-2 eficiente que se baseia em "testes de grupo não adaptativos de estágio único". Usando um esquema de pooling projetado para uma taxa de portadores de aproximadamente 1%, o método identificou corretamente todos os portadores positivos em conjuntos de 384 amostras agrupadas em 48 pools, proporcionando assim uma redução de 8 vezes no número de testes necessários.1

Qualquer estratégia de mitigação de longo prazo que permitirá que nossa sociedade saia de lockdowns rígidos exigirá um aumento significativo na capacidade de testar a população. Embora esteja claro que em muitas regiões do mundo as taxas atuais de portadores são significativamente maiores do que 8%, os períodos de bloqueio impostos em muitos lugares estão reduzindo lentamente as taxas de infecção. Portanto, prevemos que em um futuro próximo as taxas de portadores provavelmente cairão abaixo desse limite em muitos países. Nesse cenário, o P-BEST pode ser usado para realizar triagens de rotina eficientes de, por exemplo, profissionais de saúde e funcionários de lares de idosos, bem como triagens da população em geral para identificar novos pontos de transmissão do SARS-CoV-2.1

A implementação atual do P-BEST foi projetada para uma taxa de portadores de aproximadamente 1%. Para permitir uma maior eficiência do teste, isto é, para minimizar o número de pools necessários para rastrear uma determinada população, a projeção deve variar de acordo com a taxa de portadores. O desenho do pooling pode diferir pelo número de pools e pelo número de amostras por pool. Especificamente, à medida que a taxa de portadores na população aumenta, mais pools são necessários para identificar corretamente todos os portadores positivos em uma única rodada de teste. Além disso, o número necessário de amostras por pool diminui com o aumento da taxa de portadores. Por outro lado, quando as taxas de portadores são baixas, menos pools são necessários para testar o mesmo número de indivíduos, enquanto o número de amostras por pool deve ser aumentado.1 
O desempenho do P-BEST foi testado em um estudo clínico voltado para a triagem de profissionais de saúde assintomáticos e levemente sintomáticos. Usando o P-BEST, 1.115 pacientes foram rastreados utilizando um total de 144 kits de diagnóstico, destacando a eficiência do método. Devido aos rígidos lockdowns impostos em Israel, as taxas de infecção caíram significativamente em abril de 2020 e o número de novos casos por dia continuou a diminuir. Portanto, a fato de não haver nenhum portador positivo entre os 1.115 indivíduos triados não foi uma surpresa.1 

Novos exames têm sido avaliados com o objetivo de ampliar a capacidade de testar a população. O exame P-BEST é um exemplo que usa uma metodologia que reduziu em 8 vezes no número de testes necessários.

No momento, estão sendo exploradas várias melhorias para o P-BEST, incluindo:1
  • redução no tempo de montagem das placas de 5 para 1 hora;
  • adaptação para que o teste seja realizado inteiramente em um laboratório de biossegurança nível 2;
  • obtenção da estimativa da carga viral de cada portador positivo, e
  • extração do material genético viral a partir de amostras de saliva.

CONCLUSÃO


O P-BEST fornece uma solução eficiente e de fácil implementação para aumentar a capacidade de testagem, que pode ser facilmente integrada em laboratórios de diagnóstico.1
 

REFERÊNCIAS

  1. Shental N, Levy S, Wuvshet V, et al.

    Efficient high-throughput SARS-CoV-2 testing to detect asymptomatic carriers.

    Science Advances 21 Aug 2020:eabc5961. DOI: 10.1126/sciadv.abc5961