INTRODUÇÃO

O coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2) foi detectado novamente após a alta hospitalar em alguns pacientes com a doença causada pelo coronavírus 2019 (COVID-19). A razão para a positividade recorrente do teste e o potencial problema de saúde pública devido a esta ocorrência ainda são desconhecidas.1

Sabe-se que os anticorpos neutralizantes contra o SARS-CoV-2 são essenciais para o controle viral e a produção de anticorpos em pacientes com COVID-19 parece diferir significativamente entre os indivíduos. Dessa forma, os pacientes que apresentam resultados positivos de reteste podem ter a capacidade de produzir uma resposta imune protetora comprometida.1

Para investigar essa questão, o artigo apresentado analisou os dados virais e as manifestações clínicas de pacientes chineses com COVID-19 em domicílio.1

RESULTADOS

 
O trato gastrointestinal foi o principal local de recorrência do SARS-CoV-2

Foram inscritos 289 pacientes com COVID-19 com registros completos da doença e pelo menos um teste de RNA viral de acompanhamento. Swabs da faringe foram coletados para detecção de RNA viral pelo CDC local, e os pacientes com reteste positivo para RNA viral foram transferidos para um hospital para outra rodada de tratamento.1 

Os resultados da detecção de RNA viral em amostras de faringe, anal e de escarro (raras) foram verificados novamente e, no total, 21 pacientes (7,3%) foram hospitalizados duas ou mais vezes devido ao teste positivo para o RNA do SARS-CoV-2 após a alta inicial. Estes pacientes que apresentaram novamente resultados positivos foram designados grupo de reteste positivo e os demais, grupo de reteste negativo. Entre os 268 pacientes com reteste negativo, 157 pacientes (58,6%) tiveram RNA viral mensurável durante sua hospitalização inicial, e 111 pacientes apresentaram RNA viral indetectável durante sua hospitalização inicial.1 

Curiosamente, foi observado que mais amostras anais do que amostras do trato respiratório foram positivas em pacientes com reteste positivo para RNA viral (Figura 1). Entre os 128 pacientes com reteste negativo em amostras de swab anal, apenas 29 pacientes (22,7%) tinham RNA viral detectável. No entanto, uma proporção significativamente maior de pacientes com reteste positivo tinha RNA viral detectável em suas amostras anais durante a primeira admissão (7 de 13, 53,8%, p = 0,014) e mais de 70% dos pacientes com reteste positivo (15 de 21 pacientes) tinham RNA viral detectável em suas amostras de swab anal durante a segunda admissão.
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Figura 1. Frequência de detecção de RNA viral em amostras anais entre os grupos de reteste negativo e reteste positivo. (Adaptada de Hu F, et al. Cell Mol Immunol. 2020; 17: 1119–1125.1)

Uma análise posterior revelou que o RNA viral foi detectado com mais frequência em amostras anais do que em amostras de faringe (13 vs. 6 de 21 pacientes) e apenas 2 pacientes testaram positivo tanto para RNA viral em seus swabs anais quanto em amostras de faringe (Figura 2). Os resultados indicaram que o SARS-CoV-2 foi detectado principalmente no trato gastrointestinal nos pacientes com reteste positivo. Assim, os autores suspeitaram que o trato gastrointestinal possa ser um dos principais locais de replicação do vírus durante o estágio de reteste positivo.1 
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Figura 2. Detecção viral em amostras de faringe e anal em pacientes com reteste positivo durante a segunda admissão. (Adaptada de Hu F, et al. Cell Mol Immunol. 2020; 17: 1119–1125.1)

Replicação do vírus SARS-CoV-2 ativo no trato gastrointestinal

Uma vez que medidas rígidas de quarentena domiciliar impediam a possibilidade de uma nova infecção, o vírus detectado no reteste positivo foi epidemiologicamente considerado como derivado da infecção viral inicial. No entanto, ainda faltavam evidências experimentais que apoiassem diretamente esta conclusão. Por isso, os vírus obtidos de 42 amostras de faringe e anais de 16 pacientes foram sequenciados. O genoma total do SARS-CoV-2 de 3 (de 16, 18,8%) pacientes foi obtido. Um paciente já tinha sequências completas do genoma viral desde a primeira e segunda admissão 35 dias após a alta. A análise filogenética de 65 genomas do SARS-CoV-2 obtidos revelou que o vírus detectado durante a segunda admissão (swab anal) estava intimamente relacionado ao vírus original detectado durante a primeira admissão (swab da faringe). Portanto, o vírus detectado no reteste positivo se originou do vírus que causou a infecção inicial.1 

Coletivamente, os resultados apoiam a hipótese de que o SARS-CoV-2 poderia se ocultar e replicar em níveis mais baixos, principalmente no trato gastrointestinal por um longo tempo e que a eliminação viral periódica levaria a um reteste viral positivo, principalmente em amostras anais.1

O título viral e a gravidade da doença não foram relacionados à recorrência do SARS-CoV-2

Os autores investigaram se fatores como altos títulos virais e manifestações clínicas graves podem causar o rebote do vírus.1 

Primeiro, foi analisado se havia diferença no tempo para a depuração viral entre os grupos que teve o resteste positivo e o que teve reteste negativo. A depuração do RNA viral foi definida como o momento em que o segundo resultado negativo consecutivo do teste de RNA foi obtido, usando amostras da faringe ou anal. A eliminação viral foi alcançada dentro de 23–24 dias para 90% dos pacientes do grupo de reteste negativo, que tiveram apenas uma hospitalização (n = 268 pacientes), assim como para o grupo de reteste positivo durante sua primeira hospitalização (n = 21 pacientes) (Figura 3).1  
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Figura 3. Cinética da depuração do RNA do SARS-CoV-2. A depuração viral cumulativa (porcentagem, %) é exibida para os grupos de reteste negativo e reteste positivo. (Adaptada de Hu F, et al. Cell Mol Immunol. 2020; 17: 1119–1125.1)

Em segundo lugar, foram analisados os picos dos títulos virais durante a primeira admissão. Uma vez que cada paciente teve vários testes de RNA viral durante a hospitalização, os títulos mais altos de RNA viral (os valores de ciclo limiar ou Cycle threshold- Ct - mais baixos) foram escolhidos como a concentração viral representativa (Figura 4). Curiosamente, nenhuma diferença foi observada entre o grupo de reteste negativo (n = 157) e o grupo de reteste positivo (n = 18). No entanto, foi observada uma concentração viral significativamente menor nos pacientes com reteste positivo durante sua segunda admissão (n = 21, p < 0,0001 vs. grupo de reteste negativo, p = 0,0017 vs. grupo de reteste positivo durante sua primeira admissão).
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Figura 4. Distribuição de carga viral máxima. Cada ponto de dados representa a concentração viral máxima (valor Ct) em cada paciente durante toda a admissão. Ct: Ciclo limiar (em inglês: Cycle threshold). (Adaptada de Hu F, et al. Cell Mol Immunol. 2020; 17: 1119–1125.1)

Em terceiro lugar, a idade é um fator essencial que afeta os resultados clínicos da infecção por SARS-CoV-2. Com relação à distribuição da idade dos pacientes, não foi observada diferença significativa entre o grupo de reteste negativo (n = 268) e o grupo de reteste positivo (n = 21) (Figura 5). As distribuições por sexo também foram semelhantes entre esses dois grupos.
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Figura 5. Idade nos grupos de reteste negativo e positivo. (Adaptada de Hu F, et al. Cell Mol Immunol. 2020; 17: 1119–1125.1)

Então os autores suspeitaram que a persistência viral se devia à gravidade da doença. Uma análise abrangente das manifestações clínicas revelou que o grupo reteste positivo teve uma proporção menor (4,8%) não significativa de casos graves durante a primeira hospitalização do que o grupo reteste negativo (14,2%) (p > 0,05, Figura 6). Além disso, todos os pacientes apresentaram sintomas leves durante a segunda hospitalização (Figura 6).1 
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Figura 6. Gravidade dos sintomas clínicos nos grupos de reteste. (Adaptada de Hu F, et al. Cell Mol Immunol. 2020; 17: 1119–1125.1)

Coletivamente, essas observações demonstraram que o rebote viral não estava relacionado à idade, sexo ou taxa de depuração viral. Embora não tenha alcançado uma diferença estatisticamente significativa, houve uma tendência de maior concentração viral e casos mais leves nos pacientes com reteste positivo do que nos pacientes com reteste negativo durante a primeira internação.1 

Produção comprometida de anticorpos específicos anti-RBD  em pacientes com reteste positivo

Então, os autores suspeitaram que pacientes com reteste positivo podem falhar na geração de anticorpos protetores. Usando um ensaio de imunodetecção sensível que mede precisamente os anticorpos específicos do domínio de ligação ao receptor (receptor binding domain, RBD) da proteína spike, foram medidos os níveis séricos de IgM, IgA e IgM anti-RBD em diferentes estágios. Em comparação com os pacientes com reteste negativo (n = 158), os pacientes com reteste positivo (n = 21) tinham níveis significativamente mais baixos de IgM, IgA e IgG.1  

No grupo de reteste negativo:1
  • Altas concentrações de IgM foram detectadas em 2 semanas. Esses níveis aumentaram e foram mantidos até 4 semanas após o início da doença e, então, diminuíram.
  • Os níveis séricos de IgA começaram a aumentar em 2 semanas e foram mantidos até a semana 7.
No grupo de reteste positivo:1
  • Os níveis de IgM estavam baixos em alguns pacientes.
  • Houve atraso na produção de IgA até a semana 7.
O nível de IgG atingiu um platô em 3 semanas, com um valor mediano de índice de corte (COI) > 20. Os indivíduos retestados positivos geraram níveis significativamente mais baixos de anticorpos IgM, IgA e IgG específicos para RBD ao longo do curso da doença.1

Em seguida, as mudanças dinâmicas dos anticorpos foram caracterizadas. Um valor de corte de COI (cutoff index) = 5 foi usado para IgM e IgA, e COI = 10 foi usado para IgG (Figura 7). Mais de 70% dos pacientes com reteste negativo obtiveram um nível alto de IgM, mas menos de 45% dos pacientes com reteste positivo produziram um nível alto de IgM (Figura 7, superior, p = 0,0165). Mais pacientes com reteste negativos do que pacientes com reteste positivos geraram um alto nível de IgA (85% vs. 35% p = 0,0017, Figura 7, meio), assim como um alto nível de IgG (91% vs. 45% p = 0,0001, Figura 7, inferior).1
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Figura 7. Velocidade de geração de anticorpos específicos anti-RBD. São mostrados os números cumulativos de pacientes (%) com anti-RBD IgM > 5 COI (superior), IgA > 5 COI (intermediário) e IgG > 10 COI (inferior). COI: índice de corte (em inglês: cut-off index). (Adaptada de Hu F, et al. Cell Mol Immunol. 2020; 17: 1119–1125.1)

Em seguida, foi medido o potencial de neutralização do soro, em diferentes momentos, usando um sistema de infecção de células pelo SARS-CoV-2, e foi observado que os níveis de IgG e IgA, mas não de IgM, estavam bem correlacionados com os títulos de microneutralização do soro, corroborando a ideia de que os níveis de anti-RBD IgG e IgA poderiam representar a capacidade de neutralização sérica.1

Em suma, os resultados implicam que indivíduos com reteste positivo podem falhar na geração de anticorpos protetores em tempo hábil, resultando em atraso na eliminação viral.1

Desfechos clínicos diversos de pacientes com COVID-19

Os pacientes com COVID-19 apresentam sintomas clínicos variados.1 

Neste estudo, foi observado que no grupo de reteste negativo:1
  • A maioria dos indivíduos (58 de 60, 96,7%) gerou altos títulos de anticorpos IgG e/ou IgA específicos contra o RBD viral.
  • Também produziram anticorpos mais protetores (diluição > 1:128).
Curiosamente, 2 (de 60, 3,3%) pacientes com reteste negativo apesar de terem controlado a infecção, apresentavam baixas concentrações de anticorpos IgA e IgG específicos para RBD. Além disso, seu soro era incapaz de ser infectado por vírus vivos em cultura de células, o que sugere que a imunidade não-humoral contribui para o controle viral.1 

Enquanto que no grupo de reteste positivo:1
  • A maioria dos indivíduos com reteste positivo (17 de 19, 89,5%) produziu títulos baixos de anticorpos específicos para RBD.
  • A capacidade de neutralização dos anticorpos estava comprometida.
Além disso, 2 de 19 pacientes com reteste positivo geraram altos níveis de IgA específico de RBD (> 40 COI para um dos pacientes e > 120 COI para o outro) e IgG (> 60 COI para um dos pacientes), anticorpos estes com capacidade de neutralização para prevenir a infecção de células por SARS-CoV-2 vivos (diluição ≥1:32). No entanto, eles falharam em suprimir completamente a replicação viral.1

Em resumo, essas observações demonstraram que os pacientes têm um amplo espectro de manifestações clínicas e sugerem que vários ramos da resposta imune participam do controle do SARS-CoV-2.1

DISCUSSÃO


Neste estudo, foi observado que o trato gastrointestinal é o principal sítio extra respiratório de persistência do SARS-CoV-2 e de eliminação viral periódica. O trato digestório, que expressa um alto nível de enzima conversora de angiotensina 2 (ECA2), o receptor de ligação do SARS-COV-2, é um local de infecção viral eficiente.1 

Foi observado que as amostras anais de pacientes com reteste positivo foram mais frequentemente positivas para RNA viral do que as amostras anais de pacientes com reteste negativo durante a primeira hospitalização (53,8 vs. 22,7%) e que mais de 70% de reteste positivo os pacientes tinham RNA viral detectável em suas amostras anais durante sua segunda hospitalização. Esses dados sugerem que a replicação viral ocorreu no trato gastrointestinal.1 

Os resultados indicam que o trato gastrointestinal pode ser um reservatório de níveis baixos de replicação do SARS-CoV-2, o que pode levar à eliminação periódica de vírus potencialmente infecciosos. Esta descoberta destaca a necessidade de medidas rigorosas de higiene pública para prevenir a transmissão viral por pacientes com reteste positivo.1 

A concentração viral e a velocidade de depuração do RNA viral foram medidas principalmente no trato respiratório superior, e a gravidade da doença durante a primeira hospitalização não foi relacionada ao rebote viral. Os anticorpos neutralizantes desempenham um papel crítico no controle viral, limitando novas infecções e neutralizando vírus livres. Os anticorpos que têm como alvo específico o RBD da proteína spike do SARS-CoV-2 podem efetivamente impedir a entrada viral na célula. As concentrações de anticorpos podem refletir a capacidade do hospedeiro de prevenir a infecção viral. A análise de perfil de anticorpos específicos para RBD revelou que os pacientes com reteste positivo apresentaram títulos mais baixos de anticorpos IgM, IgA e IgG, além de produzi-los mais lentamente. O ensaio de microneutralização sérica subsequente também confirmou que os pacientes com retestes positivos não conseguiram gerar anticorpos neutralizantes potentes e de longa duração, ao contrário dos pacientes com retestes negativos.1

Além disso, foi observado que a recorrência viral prolonga a eliminação viral pelo reservatório do trato gastrointestinal. A análise filogenética do genoma completo do SARS-CoV-2 no estágio de reteste positivo demonstrou que o vírus detectado no reteste positivo evoluiu do vírus original, envolvido na infecção inicial. Até onde se sabe, esta é a primeira confirmação experimental da origem do vírus detectada no reteste positivo.1

Limitações do estudo 

Em primeiro lugar, como esta foi uma análise retrospectiva, a coleta de amostras não seguiu um cronograma rigoroso. Portanto, houve perda de dados ao longo do tempo para a maioria dos pacientes, principalmente no estágio inicial, quando a presença do vírus no trato gastrointestinal era ignorada.1 

Em segundo lugar, como todas as amostras coletadas de swab anal e da faringe eram inativadas, não foi possível realizar o isolamento viral ou conduzir experimentos adicionais usando vírus vivos.

Por último, a resposta celular específica ao SARS-CoV-2, que pode ser vital para eventualmente alcançar o controle viral na ausência de uma resposta humoral potente em pacientes retestados positivos, não estava disponível.1

  Em pacientes com reteste positivo, o vírus foi geralmente encontrado em amostras anais (15 de 21, 71,4%).
  O RNA viral foi detectado mais frequentemente em amostras anais do que em amostras da faringe.1 
  A persistência viral não foi associada a altos títulos virais, atraso na depuração viral, idade avançada ou sintomas clínicos mais graves durante a primeira internação.1  
  Em contraste, o rebote viral foi associado a níveis significativamente mais baixos e geração mais lenta de anticorpos IgA e IgG específicos para o domínio de ligação ao receptor (RBD) viral.1 

 


CONCLUSÃO


Em resumo, o estudo demonstrou que pacientes com reteste positivo tiveram atrasos na produção de IgA e IgG específicos para RBD e, eventualmente, apresentaram níveis relativamente baixos desses anticorpos. Esses fatores podem ter contribuído para a persistência viral no trato gastrointestinal e a subsequente eliminação viral periódica e atraso na depuração viral.1